本发明提供了一种小球藻抗氧化多肽的制备方法，其特征在于，采用高压均质法联合纤维素酶/果胶酶酶解提取小球藻蛋白，经特定蛋白酶解液酶解后，超滤膜分离，获得不同分子量区间的小球藻酶解肽。本发明经特定蛋白酶解液酶解后的分子量范围为0‑3.5 KDa的小球藻多肽具备比其他蛋白酶酶解产物及其他分子量区间的小球藻多肽更好的体外清除DPPH和羟自由基能力，体外清除肝癌细胞活性氧簇能力，更有效的动物体内过氧化产物丙二醛形成抑制能力和谷胱甘肽过氧化物酶活性促进能力。本发明依赖于特定蛋白酶酶解液以制得更佳抗氧化功能的小球藻活性肽，有利于化妆品、食品、抗氧化功能保健食品和医药产品的开发利用。